style="width:3.11331in" />
style="width:4.16666in;height:1.8733in" /> 本文是学习GB-T 18649-2014 牛传染性胸膜肺炎诊断技术. 而整理的学习笔记,分享出来希望更多人受益,如果存在侵权请及时联系我们
本标准规定了牛传染性胸膜肺炎的病原学检查、聚合酶链式反应(PCR)、
补体结合试验、竞争 ELISA(C-ELISA)
试验诊断技术要求。病原学检查和聚合酶链式反应(PCR) 适用于急性、亚急性及慢
性病牛的病原诊断，补体结合试验和竞争 ELISA(C-ELISA)
试验适用于牛传染性胸膜肺炎感染牛的抗
体检测。
本标准适用于口岸、产地及集散地、养殖企业或养殖户对牛传染性胸膜肺炎的诊断。
健康牛和病牛接触，由呼吸道吸入病牛的"飞沫"是本病的主要传染途径。在该病的常在地区多见
亚急性和慢性病程，以地方流行性为特点。但在新发生本病地区以急性经过为主。慢性病牛长期带菌，
成为隐蔽的传染源。
暴发流行时多呈急性病程，体温在41℃以上稽留。呼吸系统症状非常明显，表现为：呼吸困难，呈
腹式呼吸，咳嗽弱而无力，有浆液或脓性鼻汁流出。食欲废绝。
急性期病变以浆液渗出性纤维素性胸膜肺炎，间质多孔多汁，肺小叶出现各期肝变、多色，呈大理石
样肺，肺胸膜和肋胸膜粘连，以及胸腔渗出液大量潴留为特征。转为慢性后逐渐形成肺包膜或坏死块。
10%马血清马丁肉汤和琼脂培养基：见附录 A。
用灭菌器械(注射器、剪刀、青霉素瓶、棉拭子等)无菌采集关节液、胸腔积液、鼻腔拭子和全血，关节
液和胸腔渗出液置于青霉素瓶内。
病料均放入4℃冰箱内保存，并在24 h 内送到指定实验室。如果在24 h
内不能送达，应放入
—20℃冰箱内保存。
在无菌条件下吸取胸腔渗出液或关节液0.1 mL～0.3mL
接种于培养基中即可。鼻腔拭子用
GB/T 18649—2014
5mL 灭菌生理盐水(含有100 U/mL 青霉素)浸泡15 min 后，吸取0.1 mL～0.3mL
接种于培养基中
即可。
5.5.1.1 培养性状和菌落形态
牛传染性胸膜肺炎病原在10%马血清马丁肉汤内生长初期呈轻微浑浊或呈白色点状、丝状生长，
以后逐渐均匀混浊，半透明稍带乳光，不产生菌膜或沉淀，也无颗粒悬浮。在含有10%马血清的马丁琼
脂培养基上生长迟缓，为极小的水滴状圆形略带灰色的微小菌落，中央有乳头状突起。菌落直径约
0.2 mm～0.5 mm,肉眼不易看见，需用放大镜或低倍显微镜观察。
5.5.1.2 染色镜检
取马丁肉汤培养物涂片置于温箱中干燥后在酒精灯上轻微火焰固定，再用3%～5%铬酸蒸馏水溶
液固定1 min～2min,
水洗，浸入用蒸馏水稀释的1:30姬姆萨氏染液中染色，染液缸放入普通冰箱内
过夜。染色后取出用蒸馏水清洗，自然干燥后用800倍～1000倍显微镜观察。菌型为多形态，以球点
形最常见，大小在125 nm～250 nm。
5.5.2.1 糖发酵试验
在进行糖发酵试验时，将各种糖培养基管(见附录 B) 加无菌的马血清0.2 mL,
再加被检菌液
0.1 mL置37℃下培养5 d～7 d。
结果判定：丝状支原体丝状亚种 SC
型可轻度分解葡萄糖、麦芽糖、糊精、淀粉，产酸，使培养基变
黄，而不产气；不能分解果糖、覃糖、半乳糖和水杨苷。
5.5.2.2 **硫化氢(H₂S
将被检菌液接种于10%马血清马丁肉汤或琼脂斜面上，取一片乙酸铅滤纸条(见附录
C), 夹在试
管的棉塞下悬挂，置37℃培养5 d～7d, 滤纸条变黑或棕褐色为阳性反应。
5.5.2.3 硝酸盐还原试验
向硝酸盐还原培养基(见附录 D 中 D.1)中加10%无菌马血清，然后将被检菌液0.1
mL 接种于硝 酸盐还原培养基中，同时设不接种的对照，于37℃培养5 d～7d。 于
5 d 和 7d 时 取 1 mL 培养液置于
干净试管中，再各滴0.1 mL 试剂甲液和乙液(见 D.2),对照管同样加试剂。
结果判定：若试管菌液呈现红色或橙色者为阳性反应；如无红色出现，则可加0.1
mL 二苯胺试剂，
若呈现蓝色反应，则表示培养基中有硝酸盐存在；如不呈蓝色反应，表示硝酸盐和形成的亚硝酸盐已被
还原成其他物质，则仍判定为硝酸盐还原试验阳性反应。
5.5.2.4 靛基质试验
向靛基质试验培养基(见附录E 中 E.1)中加入10%无菌马血清，再将被检菌液0.1
mL 接种于培养 基中，37℃培养5 d～7d 后，滴加试剂0.1 mL
于培养物液面，轻轻摇动，红色为阳性反应，黄色为阴性
反应。
GB/T 18649—2014
5.5.2.5 **甲基红(MR
按10%的体积向甲基红(MR) 试验培养基(见附录 F 中 F.1)
中加入无菌马血清，再接种被检菌液 0.1mL,37℃ 培养。于培养第五天时取1 mL
培养液于另一支试管中，并加0.1 mL 试剂，如培养液呈
现红色为 MR 试验阳性；黄色者为阴性，继续培养至第七天，再进行试验。
5.5.2.6 **维培二氏(V-P
可用下列三种试剂进行 V-P 试验：
a) Barritt's 试 剂 法
取被检菌液2 mL 加甲液1 mL、 乙液0.4 mL (见附录G 中 G.1), 充分混合，在5
min 内呈粉红色反
应为阳性。
b) O'Meara's 试剂法
取被检菌液2 mL 加等量试剂(见G.2) 混合，充分振荡试剂，在5 min
内呈现粉红色者为阳性反应。
c) 硫酸铜试剂法
取被检菌液2 mL 加等量硫酸铜试剂(见 G.3) 混合，充分振荡试剂，在5 min
内呈粉红色反应为
阳性。
上述三种方法为阴性，继续培养，再进行观察。
6.1.1.1 特异性引物：SC1 和 SC2
为丝状支原体丝状亚种 SC 型 (MmmSC) 特异性引物。
6.1.1.2 引物序列。
SC1:ATATACTTCTGTTCTAGTAATATG;
SC2:CTGATTATGATGACAGTGGTCA。
6.1.1.3 引物浓度：浓度为5 pmol/μL。
6.1.2 Taq 酶(5 U/μL)。
6.1.3 电泳缓冲液(TAE)。
6.2.1.1 组织样品的采集
参照5.2进行。
6.2.1.2 标准阳性样品的处理
用 1 mL 马丁汤培养基(含10%马血清，不含抗生素)溶解冻干菌种后，加入9 mL
马丁汤内，混匀 后从中吸取1 mL
菌液加入到下一试管中，共稀释9管，另1管做空白对照。置于37℃培养箱内培养
7d～10d, 每日观察，待菌体个数达到每毫升10⁸颜色变化单位(color change
unit,CCU)时收获。
GB/T 18649—2014
使用商品化的基因组 DNA 提取试剂盒，参照说明书进行操作。
采用20μL 反应体系：
10×缓冲液 2.0 μL
2.5 mmol/L dNTPs 1.6μL
模板 DNA
10u/μL Taq 酶
纯水
总体积
1.0μL
1.0μL
12.9μL
20.0μL
瞬时离心，置 PCR 仪内进行 PCR 循环。95℃预变性3 min; 循环94℃ 45 s,57℃
45 s,72℃
1min,35 个循环后72℃延伸10 min。
采用常规方法配制的1.5%琼脂糖进行制板并电泳检测。
6.3.1 标准阳性样品扩增出277 bp
片段而空白对照不能扩增出任何条带，则 PCR 反应判定为有效。
如标准阳性样品不能扩增出目的大小片段，或空白对照扩增出目的片段，则反应无效。
6.3.2 在 PCR 反应有效的前提下，待检样品扩增出的DNA 片段为277
bp,可判定待检样品为阳性，否
则待检样品为阴性。
7.1.1 试验用巴比妥缓冲液，使用时作1:5稀释，配制方法见附录 H。
7.1.2 绵羊红细胞悬液使用阿氏液，制备方法见附录 I。
7.1.3 6%绵羊红细胞悬液制备见附录J。
7.1.4
抗原、标准阳性血清、阴性血清采用国际标准品，溶血素由兽医生物药品厂供应，按说明书使用。
溶血素效价滴定见附录 K。
7.1.5 致敏绵羊红细胞制备：使用12单位 HDs(50%
溶血程度)的溶血素与等体积的6%绵羊红细胞
混合，37℃水浴30 min, 期间间隔5 min 摇动 一 次。
7.1.6 补体效价滴定方法见附录 L。
7.1.7 抗原效价滴定方法见附录 M。
7.2.1
被检血清、标准阴性血清、阳性血清均用巴比妥缓冲液作1:10稀释，于56℃水浴中灭活
7.2.2 在96孔微量反应板中，每孔加入25μL 抗原、25μL 被检血清、25μL2.5
U 补体，振荡混匀后
37℃水浴30 min。
7.2.3 每孔加入25μL 致敏后的绵羊红细胞，振荡混匀后37℃水浴30 min。
7.2.4
设标准阳性血清、阴性血清、补体对照、溶血素对照、红细胞对照以及抗原抗补体活性对照。具
GB/T 18649—2014
体试验步骤见表1。
表 1
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37 ℃孵浴 30 min |
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30 min |
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7.3.1 96孔微量反应板125g 离心2 min 或静止10 min,
当所有对照成立的情况下，判定被检孔补体 结合百分率。
7.3.2 判定补体结合百分率方法见附录N。
当所有对照成立的情况下，判定++++为阳性；+、++、+++为疑似； 一为阴性。
对于疑似样品需重新采集血清进行复检，如果仍为疑似，则应做病理学和病原学检查。
8 竞争酶联免疫吸附试验(C-ELISA)
使用从世界卫生组织指定生产商处购买的商品化试剂盒。
8.2.1 将待检血清(1/10)和工作浓度单抗(稀释液为 pH7.4 的 PBS,
含0.5%马血清和0.05%的吐温 20)各50 μL
加入各孔中，同时设立标准阴性血清、标准强阳性血清、标准弱阳性血清以及结合物对照
孔、单抗对照孔。将ELISA 反应板置于摇床上37℃反应1 h,缓缓摇动。
8.2.2 用 PBS 溶液(pH7.4, 内含0.05%的吐温20)冲洗 ELISA
板两次，向所有孔中加入100 μL 酶结 合物，37℃反应30 min。
8.2.3 用 PBS 溶液(pH7.4, 内含0.05%的吐温20)冲洗 ELISA
板三次，向所有孔中加入100μL 底物， 37 ℃反应30 min。
8.2.4 向所有孔中加入100μL2 mol/L H₂SO₄ 终止反应，以405nm 波长读取OD
值。
a) 单抗对照孔(Cm)OD 值应在0.5～2.0之间(最好接近于1.0);
b) 结合物对照孔(Cc)OD 值应小于0.3;
c) 标准阴性血清(CN) 抑制百分比应小于35%;
d) 标准弱阳性血清(CP+) 抑制百分比在50%～80%之间；
e) 标准强阳性血清(CP++) 抑制百分比在60%～90%之间。
8.3.1 单个样品抑制率按式(1)计算。
单个样品抑制率=[单抗对照孔(Cm) 的 OD 值一样品的 OD 值]/
[单抗对照孔(Cm) 的 OD 值一标准阴性血清对照(CN) 的 OD 值]×100%
………
(1)
GB/T 18649—2014
8.3.2 被检样品抑制率等于或低于40%为阴性。
8.3.3 被检样品抑制率在40%～50%之间为疑似。
8.3.4 被检样品抑制率等于或大于50%为阳性。
8.3.5
对于疑似样品需重新采集血清进行复检，如果仍为疑似，则应做病理学和病原学检查。
本病的最终确诊需综合流行病学、临床症状、病理剖检、血清学和病原学结果进行。血清学阳性并
不表明感染本病。病原分离并鉴定是确诊本病的最重要根据。
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(规范性附录)
支原体培养基的制备
A.1 10% 马血清马丁肉汤(pH7.8～8.0)
将制备的马丁肉汤分装于灭菌试管内，每管4.5 mL, 添加无菌马血清0.5 mL。
A.2 10% 马血清马丁琼脂
马丁肉汤中加入琼脂，使含量达到1.3%～1.5%,经121 kPa 高压灭菌30 min
即成马丁琼脂。在灭 菌的6 cm～8cm 直径培养皿内加无菌马血清1 mL,
再添加煮沸融化降温至55℃~60℃的马丁琼脂
9 mL,轻轻摇动混合均匀，静置凝固后即成马丁琼脂培养基。
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(规范性附录)
糖培养基管的制备
取蛋白胨水(pH7.8～8.0)100 mL、氯化钠0.5 g、所需各种糖类0.5 g～1.0
g,溶解各成分，加入 1.6%溴甲酚紫酒精溶液指示剂0.1 mL
混匀。分装到试管中，每管2 mL, 管内装有倒置的小玻璃管(杜
汉氏发酵管)。经106.4 kPa 20 min灭菌备用。
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(规范性附录)
乙酸铅纸条的制备
取滤纸剪成6.5 cm×0.6 cm大小的纸条，置平皿中，经112 kPa20
min灭菌，烘干。再将滤纸条浸 泡在灭菌的饱和乙酸铅溶液(10 g 乙酸铅溶于50
mL 沸蒸馏水中，即为饱和乙酸铅溶液),浸透后取出，
置无菌平皿内，37℃烘干，保存于灭菌的试管中备用。
GB/T 18649—2014
(规范性附录)
硝酸盐还原试验培养基和指示剂的配制
D.1 硝酸盐还原试验培养基的配制
取营养肉汤或马丁肉汤100 mL, 硝酸钾(KNO₃)0.1g, 调 pH
至7.8～8.0,分装试管，112 kPa
D.2 指示剂的配制
试剂1:甲液：对氨基苯磺酸0.5 g,5 mol/L 乙酸；乙液：α-萘胺0.5 g,5 mol/L
乙酸100 mL。
试剂2:二苯胺试剂：二苯胺0.5 g 溶于100 mL 浓硫酸中，用20 mL
蒸馏水稀释。
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(规范性附录)
靛基质试验培养基和指示剂的配制
E.1 靛基质试验培养基的配制
蛋白胨1 g,氯化钠0.5 g,色氨酸0.1 g,蒸馏水100 mL。 溶解各成分，调 pH
至7.8～8.0,分装试
管，经106.4 kPa 20 min灭菌备用。
E.2 指示剂的配制
对二甲基氨基苯甲醛5 g,95% 乙醇75 mL, 浓盐酸25 mL。
将对二甲基氨基苯甲醛溶于乙醇中，再
缓缓加入浓盐酸即成。
GB/T 18649—2014
(规范性附录)
甲基红(MR) 试验培养基和指示剂的配制
F.1 甲基红(MR) 试验培养基的配制
蛋白胨0.7 g,葡萄糖0.5 g,磷酸氢二钾0.5 g,蒸馏水100 mL。
各成分溶解后，调pH7.8～8.0, 分
装试管。经106.4 kPa 20 min灭菌备用。
F.2 指示剂的配制
甲基红0.02 g,95% 酒精60 mL, 蒸馏水40 mL。
先将甲基红研磨，溶解于酒精中，再加蒸馏水
即成。
GB/T 18649—2014
(规范性附录)
维培二氏(V-P) 试验培养基的配制
G.1 Barritt's 试剂的配制
甲液：6%α-萘酚酒精溶液。乙液：40%氢氧化钾溶液。
G.2 O'Meara's 试剂的配制
氢氧化钾(或氢氧化钠)40 g,肌酐(creatine)0.3g,溶于蒸馏水100 mL, 经106.4
kPa 20 min 灭菌
备用。
G.3 硫酸铜的配制
1g 硫酸铜溶于40 mL 浓氨水中，加10%氢氧化钾960 mL 即成。
GB/T 18649—2014
(规范性附录)
巴比妥缓冲液(VB) 配制
| 氯化钠 | 85 g | |
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| 巴比妥酸 |
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| 巴比妥钠 |
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| 氯化镁(MgCl₂ ·6H₂O) |
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| 氯化钙(CaCl₂ ·2H₂O) |
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| 灭菌双蒸水 | 2000 |
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用盐酸调节pH 至7.3,使用时用灭菌双蒸水作1:5稀释。
GB/T 18649—2014
(规范性附录)
阿氏液配制
A 液
葡萄糖 20.5 g
灭菌双蒸水 200 mL
B 液
柠檬酸钠 12.0 g
氯化钠 4.2 g
灭菌双蒸水 800 mL
用5%柠檬酸调节 B 液 pH 至6.1。混合A 液、B 液，用蔡氏滤器过滤除菌。
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(规范性附录)
6%绵羊红细胞的制备
无菌采集健康公绵羊静脉血，脱纤后用阿氏液悬浮，1500 g 洗涤3次，每次10
min。 收集红细胞
沉淀，用阿氏液配成6%悬液，4℃放置48 h 后使用，但最多使用不超过3周。
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(规范性附录)
溶血素效价测定
溶血素效价的测定：取0.1 mL
溶血素作10倍系列稀释至1:1000作为基础液，其稀释方法见表
K. 1。
表 K.1 单位为毫升
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按照表K.2 程序加入各种试验成分，在37℃水浴30 min,1500g 离心10 min。
将100%溶血管的 液体与等体积VB
混合制成50%溶血比色管。能使红细胞液50%溶血(HDo) 的溶血素最大稀释度作
为溶血素效价，使用12个单位的 HDso。
表 K.2 单位为毫升
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如表K.2
中第8管溶血程度达到50%,而空白对照管都没有溶血现象，则该批溶血素的效价即为
1:8000,使用12个单位的 HD。,则应将溶血素作8000/12=666.6倍稀释。
GB/T 18649—2014
(规范性附录)
补体效价测定
使用VB 稀释补体，具体操作见表L.1和表L.2。
表 L.1
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表 L.2
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将1:30～1:110各稀释度补体25 μL 加入1.5 mL
离心管中，每个补体稀释度孔中加入25 μL VB,
再加入25 μL 致敏后的绵羊红细胞，振荡混匀后37℃水浴30 min 后125 g 离心2
min,判定结果。
补体效价判定：使绵羊红细胞100%溶解的补体最高稀释度即是该补体效价。检测时使用2.5
U 补
体。例如补体在1:60时使绵羊红细胞100%溶解，那么该补体效价为60,使用时应作60/2.5=24倍
稀释。
GB/T 18649—2014
(规范性附录)
抗原效价测定
M.1 用 VB 液2倍连续稀释抗原，从1:10到1:640。
M.2 用 VB 液2倍连续稀释阳性血清，从1:10到1:1280。
M.3 使用96孔微量反应板对抗原进行方阵滴定。具体操作如图 M.1。
每孔分别加入对应稀释度的抗原 25μL、阳性血清25μL、2.5
U补体25μL,振荡混匀后37℃水浴30 min。 每孔加入致敏后的绵羊红细胞
25μL,振荡混匀后37℃水浴30 min。125g 离 心 2min 判定结果。同时设0.5
U、1U、2.5U 补体对照，致
敏红细胞对照，每个抗原稀释度的抗补体对照。
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图 M.1
M.4
当对照全部成立的情况下，补体100%被结合的阳性血清最高稀释度对应的抗原最高稀释度即是抗
原效价。如图 M.1
所示，当阳性血清1:160、抗原1:80时，抗原抗体复合物能够结合100%补体，那么该
抗原效价为1:80。检测时使用2个单位，将抗原作80/2=40倍稀释。
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GB/T 18649—2014
(规范性附录)
补体结合百分率判定
补体结合百分率判定见表N.1。
表 N.1
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版权专有 侵权必究
关
书号：155066 ·1-49775
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